1991年9月26日至1993年9月26日，科学家小组在“生物圈Ⅱ号”中进行了长达两年的首次试验。在试验的初期，“生物圈Ⅱ号”不对公众开放，它成了一个神秘的领域，直到1993年中期，“生物圈Ⅱ号”的居民才同意接受摄影记者的采访，他们的生活秘密这才向世人公开。
第一期参加“生物圈Ⅱ号”实验的共有8位科学工作者，4男4女。他们与世隔绝，除了能源（阳光和电力）和信息来自“生物圈Ⅱ号”之外，圈内所需的空气、水以及食物均由“生物圈Ⅱ号”自行解决，它产生的废物也在圈内处理解决。“生物圈Ⅱ号”内种植有3800种植物，还饲养了一些家禽和家畜。这个与世隔绝的“生物圈Ⅱ号”可以说是一个模拟地球生态环境的“微型地球”。
“生物圈Ⅱ号”的“居民”的工作是从开垦土地、种植小麦和蔬菜开始的。由于种植各种作物需要时间，他们初期吃的食物是从外面带进去的。4个月后，他们种植的小麦有了收获，遂将其加工成面粉，烘制出面包。“生物圈Ⅱ号”的“居民”琳达过生日时的菜单中有蛋糕、西红柿、辣椒、洋葱、茄子、鸡肉、用羊奶制的乳酪、木瓜、无花果、香蕉、莴苣、洋白菜、米饭、咖啡、芹菜、南瓜等19个品种，这说明他们种植蔬菜的品种是多种多样的。只是为了避免污染圈内的空气，他们才未在蛋糕上插上点燃的生日蜡烛。
他们的农业生产并不一帆风顺，由于冬季日照时间短和病虫害的影响，他们的谷物减产。因此，在开始的6个月中，他们不得不减少粮食定量，每天摄取的热量仅为1800千卡，比规定的2500千卡少了不少，但由于采用了低热量、低脂肪、高营养的食物，对于他们的健康产生了很好的结果，他们的血压、血脂、血糖值比进入生物圈以前有了大幅度的降低，只是他们的体重也减轻了不少。
“生物圈Ⅱ号”在试验过程中遇到过一些困难，为了解决这些困难，不得不改变原来设定的封闭条件，这就使一些人对其科学性提出疑问。例如，在封闭实验开始后第二周，“生物圈居民”简小姐的手指受了伤，不得不离开生物圈“保外就医”，当她返回生物圈时，又被恩准带回不少物品。再拿空气来说，原设想圈内的空气应在整个生态环境中循环，即人吸入氧气，吐出二氧化碳，圈中绿色植物则通过光合作用吸收二氧化碳放出氧气。为了保险起见，圈中还安装有二氧化碳循环器来净化空气。到1991年12月，也就是“生物圈Ⅱ号”起动后3个多月，为了补充圈中泄漏的空气，“生物圈Ⅱ号”又从圈外补充了10%的空气。由于这些事件的发生，外界有人指责生物圈试验缺乏科学价值。
尽管有着争议，科学家还在继续进行着试验。1994年3月6日，“生物圈Ⅱ号”开始了第二期试验，来自美国、英国、加拿大、墨西哥和尼泊尔的5男2女共7位科学家开始了他们为期10个半月的“与世分隔”的生活。
为了重树“生物圈Ⅱ号”的科学可信度，这次试验在指导思想上作了引人注目的改变。这次实验的投资者——美国太空生物圈投资风险公司决定对“生物圈Ⅱ号”实行“门户开放”政策，允许科学家和一些参观者进入“生物圈Ⅱ号”作短期停留，“生物圈Ⅱ号”的常住居民也可以偶然走出圈外，这对于克服圈内居住的孤独感也是大有好处的。
在试验开始3个月之后，一名医生进入“生物圈Ⅱ号”，为7名常住居民上门看病。按计划还会有3名科学家进入圈内，进行短期科研工作。据透露，被允许进入“生物圈Ⅱ号”做客的，可能会有教师、技术专家、项目经理、环境专家甚至一些商界人士。他们在圈中可待上几周甚至几个月，但这些客人进入圈中之后，必须在圈内农场上干活，亲自品尝一下自己动手丰衣足食的甘苦。
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